Практика показывает, что в нашей стране многие ученые, до сих пор, снимают результаты Вестерн-блотов по старинке, дедовскими способами, т.е.:
Процессы проявки очень растянуты по времени и крайне трудозатратны. И, при этом, можно рассчитывать разве что на качественный или полуколичественный, но ни как не на истинный количественный, анализ блотов. При попытках сделать более или менее количественную оценку результатов, экспериментатор сталкивается с массой проблем, основная из которых – непостоянство ферментативной активности пероксидазы. Активность пероксидазы не является линейной, а описывается сложной функцией, зависящей от большого количества самых разнообразных факторов. Из-за этого, для количественной оценки результатов, приходится строить калибровочные кривые. При этом, вследствие эффектов насыщения, у данных калибровочных кривых, линейный диапазон крайне не широк, 1 – 2 порядка.
Кроме того, сигналы высокой интенсивности, зачастую, полностью маскируют сигналы меньшей интенсивности, а, чтобы надежно засечь несколько различных сигналов, приходится резать мембраны или проводить многократные процедуры отмывки и повторной гибридизации. При большом же скоплении вторичных антител (часто бывает при большом скоплении целевого белка), субстрат локально выгорает, прежде чем вы успеете засечь сигнал. Как результат, появляется белый (выгоревший) участок в центре полосы. Соответственно, о количественной оценке данного сигнала можно забыть.
Ввиду сложности количественной оценки Вестерн-блотов, концентрации целевых белков аппроксимируют по содержанию матричных РНК в препаратах, переводя их в кДНК и ставя количественные ПЦР в реальном времени.
Но, на самом деле, данная техника также далека от идеала, т.к. содержание матричных РНК отнюдь не прямопропорционально концентрациям целевых белков. Кроме того, РНК – гораздо менее стабильная субстанция, по сравнению с белком, и в процессе пробоподготовки, при проведении количественных ПЦР в реальном времени, неизбежно накапливается ошибка. Причем, ввиду сложной функциональной зависимости, величину данной ошибки очень определить практически не возможно.
Между тем, в последнее время, активно развивается технология детекции результатов Вестерн-блотов на основе флуоресценции. В данном случае, вторичные антитела сшивают не с пероксидазой, а с флуорофором, дающим свечение при возбуждении светом определенной длины волны. Такой подход позволяет существенно расширить возможности количественной оценки результатов, т.к.:
Однако, при работе с флуоресцентными красителями, для получения качественного результата, нужно следующие моменты:
Компания ЛАБИНСТРУМЕНТЫ представляет Вашему вниманию продукцию компании LI-COR Biosciences (США).
Компания LI-COR является мировым лидером в производстве документирующих систем.
В ассортименте компании LI-COR имеются:
В системах производства компании LI-COR Biosciences все рассмотренные выше моменты учтены и доведены до совершенства.
Все это, наряду с передовым программным обеспечением Image Studio позволяет добиться поистине феноминальной четкости изображений и точности количественного анализа.
Краткое описание технических характеристик и функционала систем серии Odyssey:
Тип системы / приложение | ODYSSEY DLx Гибкая, универсальная и мощная система | ODYSSEY XF Гибридная система (ИК-флуоресценция + хемилюминесценция) | |
Максимальная область сканирования | 25 см x 25 см | 10 см x 12 см | |
Разрешение | 21-337 мкм | 125 мкм | |
Источник возбуждения | Точечный лазер | Равномерное по всему объему освещение лазерным пучком | |
Метод определения | Лавинный фотодиод | CCD | |
Динамический диапазон | 4 порядка (ручной режим) > 6 порядков (AutoScan) | > 6 порядков | |
Документация инфракрасных Вестерн-блотов | + | + | |
Детекция хемилюминесценции | - | + | |
Документация гелей с окрашиванием по Кумасси | + | + | |
Детекция продуктов окрашенных Syto 60 | + | + | |
Детекция нуклеиновых кислот окрашенных этидиум бромидом | - | + | |
Детекция нуклеиновых кислот окрашенных семейством красителей SYBR® | - | + | |
Анализ In-Cell вестернов | + | - | |
Анализ On-Cell вестернов | + | - | |
Анализ белковых микрочипов | + | - | |
EMSA | + | - | |
Получение изображений тканевых срезов | + | - | |
Получение изображений целых органов | + | - | |
Получение изображений малых животных | + | - | |
ELISA, FLISA | + | - |
Если же вам не требуется столь широкий функционал и точный количественный анализ Вестерн-блотов и вас полностью устраивает хемилюминесценция, но, при этом, вы хотели бы отказаться от использования фотопленки и специальной фотолаборатории, можем вам предложить портативный планшетный сканер C-DiGit, производства компании LI-COR.
Данный сканер специально разработан для получения высококачественных изображений хелилюминесцентных вестерн-блотов в цифровом формате.
Блот-сканер C-DiGit от компании LI-COR представляет собой компактное, предварительно настроенное, готовое к использованию, высокопроизводительное и высокочувствительное сканирующее устройство, предназначенное для детекции хемилюминесцентных вестерн-блотов.
Компактный дизайн блот-сканера позволяет разместить его прямо на рабочем столе, например как вортекс или микро-центрифугу.
Отсутствие необходимости в предварительных настройках и функция сканирования «одной кнопкой» позволяют легко и быстро начать использовать прибор и получать высококлассные изображения, а интуитивно понятный интерфейс программного обеспечения LI-COR Image Studio дает возможность быстро и эффективно провести анализ полученных результатов.
Принцип сканирования позволяет избежать взаимовлияния сигналов.
Файлы изображения, полученные с помощью блот-сканера C-DiGit, содержат полный диапазон данных хемилюминесценции.
За один «прогон» вы получаете высококачественные изображения как самых интенсивных, так и самых слабых сигналов.
Дружественное к пользователю программное обеспечение Image Studio, поставляемое в комплекте с блот-сканером C-DiGit, представляет собой мощный и простой в использовании инструмент для анализа изображений вестерн-блотов.
При этом, блот-сканер C-DiGit позволяет избежать трудоемкого процесса проявки пленки и оптимизировать затраты лаборатории, исключив затраты на специальную фотографическую пленку, дорогостоящие реагенты и содержание фотолаборатории.
Блот-сканер C-DiGit от компании LI-COR является прибором, сочетающим в себе удобство в работе, отличную функциональность и привлекательную цену.
Продукция компании отличается передовыми техническими характеристиками, высокой надежностью, пользовательски-ориентированным и интуитивно понятным интерфейсом и прекрасным соотношением "цена-качество-функциональность". Компания LI-COR осуществляет непрерывную поддержку всего своего оборудования. Нет необходимости каждый раз приобретать что-то новое, т.к. с помощью разнообразных наборов аппаратной модификации выпускаемых компанией LI-COR ваше оборудование сможет долго оставаться на самом передовом крае технологий.
По всем взаимосвязанным вопросам, пожалуйста, обращайтесь к ответственным менеджерам компании «ЛАБИНСТРУМЕНТЫ».
Комментарии
Пока никто не оставлял здесь записей.